Probemix에는 특정 게놈 서열을 표적으로하는 프로브가 있습니다. MLPA 프로브는 왼쪽 및 오른쪽 프로브 올리고뉴클레오타이드 (LPO 및 RPO)의 두 부분으로 구성됩니다. LPO 및 RPO는 PCR 프라이머 및 DNA 혼성화 서열을 포함합니다. RPO에 추가되는 stuffer 시퀀스는 각 프로브에 고유한 길이(length)를 부여합니다.
샘플 변성 및 프로브 혼성화
첫 번째 단계에서는 정제 된 샘플 DNA가 변성됩니다. 그 다음 MLPA 프로브 올리고와 함께 하룻밤 동안 배양합니다. 각 프로브의 LPO 및 RPO는 바로 인접한 표적 DNA 서열에 혼성화합니다.
프로브 결찰
두 번째 단계는 바로 인접한 표적 서열에 혼성화 된 프로브 올리고 간의 결찰입니다. 결찰 부위 주변에 불일치(mismatch)가 있으면 결찰이 이루어지지 않으므로 결찰 반응은 매우 특이적입니다. 프로브 결찰 산물의 수는 샘플의 표적 서열수에 대한 척도입니다.
프로브 증폭
세 번째 단계에서는 단일 범용 프라이머 쌍을 사용하여 멀티플렉스 PCR로 결찰 된 프로브를 증폭합니다. 결찰 된 프로브만 기하급수적으로 증폭되므로 결합되지 않은 프로브 및 결찰되지 않은 프로브를 별도로 제거 할 필요가 없습니다.
단편 분리
네 번째 단계는 모세관 전기영동에 의한 단편 분리입니다. PCR 산물은 모세관 전기영동 장치에 로드되고 길이별로 분리됩니다. 각 단편은 특정 MLPA 프로브에 해당합니다.
데이터 분석
마지막 단계는 Coffalyser.Net에 의한 데이터 분석입니다. 상대적 복제수는 테스트 샘플에서 참조 프로브 및 대상 프로브의 상대적 피크 높이를 알려진 정상 복제수를 가진 참조 샘플의 상대적 피크 높이와 비교하여 결정됩니다. 고급 품질 검사는 신뢰할 수 없는 데이터를 인식하는 데 도움이됩니다.
