HRP–Antibody All-in-One™ Conjugation Kit

CAT. NO.

SIZE

A-9002-001

1 Kit

 Description

HRP-Antibody All-in-One Conjugation Kit는 항체 100µg에서 HRP-Antibody conjugate를 생성하는 데 필요한 모든 것이 포함되어 있습니다. 키트에는 결합되지 않은 HRP와 항체를 제거하기 위한 정제 컬럼이 포함되어 있어 검출 수준이 우수하고 비특이적 결합도가 낮은 conjugate를 생성합니다.

 Specifications

 Conjugation Targets

Antibody

 Label/Modifier Type

HRP

 Reactivity 

Amine

 Recommended Storage

4°C

 Applications

Antibody Labeling, Antisense/RNAi, Aptamers, Immunotherapeutics, In Situ Proximity Ligation, In vitro Diagnostic (IVD), Laboratory Developed Tests (LDT), Analyte Specific Reagents (ASR)

 Kit Components

▶ S-HyNic (2 x 100 μg)
▶ 4FB-HRP (2 x 50 μl)
▶ 1X Modification Buffer (10 mL)
▶ Q Binding Buffer A (5 mL)
▶ Q Elution Buffer A (1.6 mL)
▶ Red Cap Spin Column (2)
▶ Yellow Cap Spin Column A (2)

▶ Brown Cap Spin Column A (2)
▶ Blue Cap Spin Column A (2)
▶ Q Spin Column (2)
▶ Q Collection Tubes (4)
▶ Anhydrous DMF (1.5 mL)
▶ 30K MWCO Vivaspin Filter (2)
▶ 2 mL Collection Tube (16)

 Documents

A-9002 Product Insert
A-9002 Product Manual

 Technical Information

A. Product Description

각 HRP‐Antibody All‐in‐One Conjugation Kit는 고도로 정제된 antibody‐HRP conjugate를 생성하는 데 필요한 모든 구성 요소를 제공합니다. 이 독특한 키트에는 conjugate를 높은 수율로 정제하기 위해 고활성의 horseradish peroxidase (>250U/mg)와 새로운 Q spin filter가 포함되어 있습니다. 생성된 conjugate에는 잔류 항체 및 HRP가 없으므로 최대의 신호 대 잡음비 (signal-to-noise ratio)를 제공합니다. 적절하게 정제된 모든 단클론 또는 다클론 포유류 항체 (IgG subclass에 관계없이)는 5시간 (조작 시간은 1시간 이내) 이내에 결합 및 정제가 가능합니다.

All‐in‐One Conjugation Kit는 SoluLINK의 검증된 HydraLINK chemistry를 기반으로 합니다. 이 화학 작용은 방향족 hydrazine이 방향족 aldehyde와 반응하여 안정된 hydrazone 결합을 형성합니다. HydraLINK 결합은 항체 100%를 conjugate로 변환할 정도로 효율적입니다. 이러한 효율성은 소량의 aniline이 두 작용기 사이의 hydrazone 결합 형성을 촉매한다는 최근의 발견으로 인해 가능해졌습니다. Aniline은 온화한 반응 조건 (mild condition)에서 결합 형성의 속도와 효율성을 모두 증가시켜 유리 항체를 HRP conjugate로 양적으로 전환되도록 합니다.

항체의 conjugate로의 완전한 전환은 이후 정제 과정을 크게 단순화시킵니다. Q spin filter membrane에 conjugate가 선택적으로 결합되고 과잉 HRP가 결합되지 않은 채 흘러 나갑니다. Spin filter는 conjugate 수율을 희생시키지 않으면서 높은 순도를 보장합니다. All‐in‐One Conjugation Kit로 생성된 conjugate는 Western blot, ELISA 또는 IHC와 같은 모든 응용분야와 호환됩니다. 각 키트는 두 번의 결합 반응을 수행하기에 충분한 시약을 제공하며 각 반응은 50‐70 μg의 고순도 HRP‐antibody conjugate를 산출합니다.

B. All‐in‐One Technology
Conjugation Chemistry
HydraLINK chemistry는 두 개의 상호 보완적인 heterobifunctional linker인 S‐HyNic과 Sulfo‐S‐4FB에 기반합니다 (Figure 1). S‐HyNic (Succinimidyl‐6‐hydrazino‐nicotinamide)는 우선 라이신 잔기의 acylation을 통해 방향족 hydrazine (HyNic groups)을 변형하고 항체에 통합하는 데 사용됩니다. 비슷한 방식으로 두 번째 linker인 Sulfo‐S‐4FB (Sulfo‐N‐succinimidyl‐4‐formylbenzamide)는 4FB–HRP (키트에 포함)라고 하는 사전 활성화된 고활성 HRP를 공급하는 데 사용됩니다. Aniline 촉매가 존재하는 상태에서 사전 활성화된 4FB‐HRP와 HyNic‐modified 항체를 배양하면 안정적인 bis‐arylhydrazone 결합이 형성되고 이를 통해 항체를 빠르고 효율적으로 conjugate로 변환합니다 (Figure 2).

Figure 1. HRP를 항체에 결합하는데 사용되는 S‐HyNic과 Sulfo‐S‐4FB linker의 구조 

Figure 2. HyNic‐modified 항체와 4FB‐HRP의 결합을 촉매하는 aniline

Conjugate Purification
Aniline 촉매에 의한 hydrazone 결합 형성의 효율성은 conjugate 정제를 크게 단순화합니다. 온화한 반응 조건 (mild condition)에서 결합 형성의 속도와 효율성을 모두 높이는 aniline의 능력은 유리 항체를  conjugate로 정량적으로 변환시킵니다. 촉매 반응 끝에 유리 항체가 완전히 제거되어 두 가지 요소, 즉 conjugate와 과잉 HRP만을 남깁니다. Q spin filter는 IgG의 생물리학적 특성을 바탕으로 conjugate에 선택적으로 결합하는 동시에 유리 HRP가 흘러 나갈 수 있도록 합니다. 그후 필터 membrane에서 정제된 conjugate만 높은 수율 (50‐70 μg)로 용출할 수 있습니다.

Figure 3. Q spin filter를 사용한 HRP‐IgG conjugate 정제

C. All‐in‐One Conjugation Process Summary

Figure 4. HRP‐Antibody All‐in‐One conjugation 과정