A. Product Description ChromaLINK Digoxigenin One-Shot Antibody Labeling Kit는 100 μl의 버퍼에 재부유된 100 mg의 항체에 digoxigenin 라벨을 통합하도록 특별히 설계되었습니다. 이 키트는 약 90분 내에 소량의 항체를 라벨링하고 통합된 digoxigenin을 신속하게 정량화하는 데 필요한 모든 구성요소가 제공합니다. Digoxigenin은 오랫동안 스트렙트아비딘/바이오틴 시스템의 대체 hapten reporter 시스템으로 사용되어 왔습니다. 이 시스템은 digoxigenin의 유일한 천연 공급원인 디기탈리스 (Digitalis purpurea)의 꽃과 잎에서 분리된 스테로이드를 기반으로 합니다. 따라서 digoxigenin에 대해 생성 된 고친화성 항체는 고등 유기체에서 발견되는 다른 생물학적 분자와 사실상 교차 반응을 나타내지 않습니다. 이 “parallel” hapten-reporter 시스템의 특수성과 민감성이 바이오틴 기반 검출 시스템에 비해 digoxigenin의 주요한 이점을 제공합니다. 보다 최근에는 이 reporter 시스템을 바이오틴-스트렙트아비딘 시스템과 연계하여 멀티플렉스 항원을 검출하는 데도 이용되고 있습니다. 그러나 바이오틴/스트렙트아비딘 시스템과 달리 digoxigenin 라벨에는 지금까지 결합을 직접 정량화하는 방법이 없었습니다. ChromaLINK Digoxigenin One-Shot Antibody Labeling Kit에 사용되는 라벨링 프로세스는 특허받은 UV-traceable linker인 Sulfo-ChromaLINK Digoxigenin을 기반으로 합니다 (Figure 1). 이 첨단 digoxigenin 라벨링 시약에는 방향성이며 수용성인 N-hydroxy-sulfosuccinimidyl ester 작용기 (a)가 들어 있어 인산염 완충 시스템에서 단백질의 라이신 잔기를 효율적으로 변형합니다. Linker는 또한 내장된 bis-aryl hydrazone 구조 (b)를 가지고 있는데, 이 구조는 이 화합물의 UV-traceable chromophore를 형성합니다. 이 추적 가능한 특징은 항체에 부착된 digoxigenin (c)의 비파괴적인 직접 정량화를 가능하게 합니다. 이러한 다양한 요소는 long-chain PEG3 spacer (d)를 통해 서로 연결되어 항체 용해도를 유지하면서 항체-digoxigenin 결합 친화력을 보존합니다. Figure 1. ChromaLINK Digoxigenin (C52H67N6NaO17S; M.W. 1103.17)의 구조 B. Features and Benefits ChromaLINK Digoxigenin One-Shot Antibody Labeling Kit는 digoxigenin을 소량 (100μg)의 항체에 통합하는 편리하고 비용 효율적인 방법입니다. 통합된 digoxigenin은 비파괴 UV-scan (220-400nm)을 사용하여 신속하게 정량화됩니다. 이 키트는 일관된 digoxigenin 통합으로 항체 회수율 (50~80%)이 높은 것이 특징입니다. 통합 정도 또는 molar substitution ratio (MSR)는 항체당 2-8 digoxigenin 분자입니다. 키트는 모든 포유류 IgG, IgE 및 조류 IgY 분자를 포함한 다양한 항체 그룹에 라벨을 붙이는 데 사용될 수 있습니다. 간단한 프로토콜로 라벨링하고 통합된 digoxigenin을 정량화하는 강력한 방법을 제공합니다. 이러한 특징은 이후의 모든 응용분야에서 더 큰 자신감, 일관성 및 재현성을 제공합니다. C. ChromaLINK One-Shot Process Diagram ChromaLINK Digoxigenin One-Shot Antibody Labeling Kit의 항체 라벨링 절차는 Figure 2와 같습니다. Figure 2. ChromaLINK Digoxigenin One-Shot 항체 라벨링 과정
D. Process Summary 1. 샘플 준비 : 100 μL 버퍼에 항체를 1 mg/mL로 준비 2. 1차 샘플 분석 : Spectrophotometer를 이용하여 항체 농도 확인 3. 1차 버퍼 교환 : Spin column과 버퍼 교환 항체를 안정화 (equilibration) 4. 2차 샘플 분석 : Spectrophotometer를 이용하여 회수된 항체 농도 재확인 5. Digoxigenin 라벨링 : ChromaLink Digoxigenin linker를 사용하여 항체 라벨링 6. 2차 버퍼 교환 : Spin column으로 과잉 라벨링 시약 제거 7. Digoxigenin 통합 정량화 : Spectrophotometer를 사용하여 통합 정량화 E. Important Labeling Parameters ChromaLINK Digoxigenin One-Shot Antibody Labeling Kit는 Table 1과 같이 적합한 버퍼 100 μl에 재부유된 100 mg의 항체에 digoxigenin을 통합하도록 설계되었습니다. Initial Antibody Concentration | Initial Mass of Antibody | Initial Antibody Volume | 1.0±0.1 mg/ml | 100±10 ug | 100 ul | Table 1. ChromaLINK Digoxigenin One-Shot 과정에 요구되는 초기 조건 키트는 다음과 같은 반응 변수를 제어하여 digoxigenin의 일관되고 신뢰할 수 있는 통합을 제공합니다:
● 최초 항체 질량 (100 μg) 및 부피 (100 μl) ● 반응 버퍼 구성 ● 반응 시간 (60분) ● 반응 화학양론 (15-fold mole-equivalents of linker) Digoxigenin 통합에 중요한 것은 샘플의 완전 회수와 함께 항체의 최초 농도를 비파괴적인 방법으로 정확하게 결정하는 능력입니다. 이 키트는 이 작업을 수행하기 위해 단일 파장 (280nm) 측정이 아닌 스펙트럼 스캔 (220-400nm)을 사용합니다. 상업용 항체는 종종 샘플의 본질적인 A280을 가리거나 왜곡하는 방부제 또는 기타 첨가제를 포함합니다. 첨가제는 단일 파장 (A280)으로 단백질 농도를 정확하게 추정하기 어렵게 합니다. 그러나 스캔은 더 큰 스펙트럼 정보를 포함하며, 종종 단백질 농도의 정확한 추정에 방해가 되는 것으로 알려진 스펙트럼 변경 첨가제의 존재를 드러냅니다. 일반적으로 사용되는 첨가제는 sodium azide, thimerosal, BSA 또는 젤라틴과 같은 단백질 안정제, glycine이나 trehalose와 같은 작은 분자 첨가제를 포함합니다. 상업용 항체 샘플에 이러한 첨가물이 포함되어 있는 경우, 부록에 있는 문제 해결 가이드를 참조하여 라벨링 절차에 방해가 될 수 있는 물질을 확인합니다. BSA 또는 젤라틴과 같은 단백질 운반체는 반드시 제거해야 라벨 부착이 진행됩니다. |