R-PE Antibody Conjugation Kit

CAT. NO.

SIZE

P-9002-002

1 Kit

 Description

R-PE Antibody Conjugation Kit에는 최대 1.3 mg의 항체에 2회 반응하는데 충분한 물질이 들어 있습니다. SoluLINK® bioconjugation technology를 기반으로 반응 속도가 빠르고 수율이 높아 거의 100%의 항체를 PE conjugate로 변환합니다. 이 키트는 과도한 R-PE를 제거하기 위한 정제 과정이 필요하지 않거나 크로마토그래피 (size exclusion FPLC 등)에 의해 정제가 수행되는 용도에 이상적입니다.

 Specifications

 Conjugation Targets

Antibody

 Label/Modifier Type

R-PE

 Reactivity 

Amine

 Recommended Storage

25°C

 Applications

Antibody Labeling, Antisense/RNAi, Aptamers, Immunotherapeutics, In Situ Proximity Ligation, In vitro Diagnostic (IVD), Laboratory Developed Tests (LDT), Analyte Specific Reagents (ASR)

 Kit Components

▶ S-HyNic (1.0 mg vial)
▶ 4FB-R-PE (1.5 mg)
▶ 10X Modification Buffer (1.5 mL vial)
▶ 10X Conjugation Buffer (1.5 mL vial)
▶ 100 mM Aniline Buffer (1 mL vial)

▶ 0.5 mL Zeba (4)
▶ DMF (anhydrous) (1 mL vial)
▶ 2-Sulfobenzaldehyde (100 mg)
▶ 10X MES Buffer (1.5 mL vial)
▶ Collection tubes (12)

 Documents

P-9002 Product Insert
P-9002 Conjugation Calculator
P-9002 Product Manual

 Technical Information

A. R-PE-Antibody Conjugation Kit Using SoluLINK’s HydraLINK Technology

1. 소개: 과거의 maleimido/thiol 기반 프로토콜에 비해 R-PE-antibody conjugate를 보다 쉽고 효율적으로 준비하기 위한 HydraLINK conjugation technology를 사용하였습니다. 키트에는 2단계의 결합을 수행하는 데 필요한 모든 시약과 버퍼가 포함되어 있습니다.
2. 장점: SoluLINK의 R-PE-antibody bioconjugation technology는 다음과 같이 maleimido/thiol 기반 방식보다 우수합니다:

• 향상된 효율성: 95% 이상의 항체가 conjugate로 전환되며, 결합을 생성하기 위해 항체 몰당 1-1.5 몰당량 (molar equivalent)의 R-PE 만 필요합니다.
• 더 쉬운 정제: 유리 항체가 conjugate로 전환되는 비율이 95보다 높습니다. 따라서 정제된 conjugate를 얻기 위해서는 과잉 R-PE만 제거하면 됩니다. 많은 응용분야에서는 정제가 필요하지 않습니다.
• 제어 가능: 중합 수준, 즉 conjugate의 밝기는 항체의 HyNic modification 수준을 조정하여 제어할 수 있습니다. Flow cytometry에는 heterodimer 제품이 선호되며, 이 기술을 사용하여 쉽게 이 구조의 준비를 최적화할 수 있습니다.
• 온전한 항체에 통합: 다른 결합 방법은 항체를 다양한 종으로 절단하는 disulfide bond의 DTT 환원에 의해 항체에 thiol을 노출합니다. 그러나 SoluLINK의 기술은 온전한 항체에 HyNic moiety를 부드럽게 통합합니다.

B. Introduction to SoluLINK Bioconjugation Technology
SoluLINK bioconjugation technology는 방향족 hydrazine과 방향족 aldehyde의 반응으로 형성된 안정적인 결합 형성을 바탕으로 한 기술입니다 (Figure 1). S-HyNic (Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate aceton hidrazone, SANH)은 생체 분자에 방향족 hydrazine linker를 통합하는 데 사용됩니다. S-HyNic은 생체분자와 표면에 있는 아미노 그룹을 HyNic 그룹으로 직접 변환하는 아미노 반응형 시약입니다. S-4FB (succinimidyl 4-formylbenzoate, SFB)는 아미노 그룹을 방향족 aldehyde (4-formylbenzamide (4FB) group) 그룹으로 변환하는 데 사용됩니다. 4FB-modified R-PE에 HyNic-modified 생체분자를 추가하면 bis-arylhydrazone 결합을 통해 conjugate가 형성됩니다. Bis-arylhydrazone 결합은 92°C의 온도와 pH 2.0-10.0에도 안정적입니다. 항체 결합의 권장 pH는 6.0입니다. 

Figure 1. SoluLINK의 HydraLINK bioconjugation technology을 사용하여 R-PE-항체 conjugate를 준비하기위한 2 단계 프로토콜. 1 단계는 HyNic-항체를 준비하기 위해 항체를 S-HyNic으로 변형. 2 단계는 HyNic-항체dhk 4FB-R-PE를 100 mM phosphate, 150 mM NaCl, 10 mM aniline, pH 6.0에서 혼합하여 conjugate 형성

HyNic-4FB 결합 커플의 장점은 다음과 같습니다:

1. 높은 반응 수율: 통상적인 결합 수율은 시작 단백질을 기준으로 40-60%입니다.
2. 효율적인 반응: Dirksen et al.은 aniline이 Schiff’s base 형성을 촉매한다는 것을 발견했습니다. 이것은 특히 큰 생체분자 결합에 효과적입니다. 항체-단백질 결합의 경우, 반응 혼합물에 10 mM aniline을 첨가하면 1-1.5 몰당량의 두 번째 단백질을 사용하여 약 2시간 이내에 항체의 95% 이상을 conjugate로 변환합니다.
3. 안정적 결합: Bis-arylhydrazone 결합은 92°C의 온도와 pH 2.0-10.0에도 안정적입니다.
4. 반응조건이 온화하며 (mild condition) 항체 변성이 없음: Disulfide bond를 분해해 단백질의 활성을 저해할 수 있는 환원 시약이 필요한 thiol 기반 결합 프로토콜과 달리 HyNic-4FB 결합 커플은 disulfide bond를 그대로 둡니다. 금속, 산화제 또는 환원제가 필요하지 않습니다.
5. 분광학적으로 결합 추적 가능: HyNic-4FB conjugate 결합은 chromophoric으로 354 nm에서 흡수되며 29,000의 molar extinction coefficient을 갖습니다. 이를 통해 (1) 결합 반응의 실시간 분광학적 모니터링, (2) 크로마토그래피 정제 중 UV 또는 photodiode array detector를 사용한 conjugate 시각화, (3) conjugate 정량화가 가능합니다.

C. The Keys to Success
SoluLINK bioconjugation technology를 사용하여 R-PE 항체 conjugate를 재현성 있게 성공적으로 준비하기 위해 반드시 충족해야 하는 세 가지 중요한 요건이 있습니다:

1. 항체 버퍼 교환: 변형 전 시작 항체를 Modification Buffer, pH 8.0로 완전히 교환하여야 합니다.
2. 최소 수준의 HyNic-modification: Colorimetric assay에 의해 결정된 HyNic-antibody molar substitution ratio (MSR)는 3.5 미만이어야 한다.
3. 결합반응에서 HyNic-antibody의 최종농도는 1.5 mg/mL 이상이어야 합니다.