Protein–Protein Conjugation Kit

CAT. NO.

SIZE

S-9010-1

1 Kit

 Description

SoluLINK® Protein-Protein Conjugation Kit는 단백질과 단백질을 쉽고 효율적으로 결합할 수 있도록 설계되었습니다. 이 키트는 bioconjugation 경험이 거의 없거나 전혀 없는 연구자들도 자신의 연구 필요에 맞게 맞춤형 단백질-단백질 conjugate를 만들 수 있도록 합니다. 분자량이 7kDa 이상인 두 단백질의 신속하고 특이적인 교차 결합을 위해 S-HyNic 및 S-4FB를 포함하여 필요한 모든 구성요소가 포함되어 있습니다. 최대 650µg인 두 개의 단백질의 단백질-단백질 conjugate를 생성하는데 충분한 시약이 들어 있습니다.

 Specifications

 Conjugation Targets

Protein

 Label/Modifier Type

Protein

 Reactivity 

Amine

 Recommended Storage

4°C

 Applications

Antibody Labeling, Antisense/RNAi, Aptamers, Immunotherapeutics, In Situ Proximity Ligation, In vitro Diagnostic (IVD), Laboratory Developed Tests (LDT), Analyte Specific Reagents (ASR)

 Kit Components

▶ S-HyNic (2 x 1 mg)
▶ S-4FB (2 x 1 mg)
▶ 10X Modification Buffer (1.5 mL)
▶ 10X Conjugation Buffer (1.5 mL)
▶ 10X TurboLink Catalyst Buffer (1.5 mL)
▶ 7kDa, 0.5mL Zeba Columns (10)

▶ Anhydrous DMF (2 x 1.5 mL)
▶ 2-Hydrazinopyridine(2-HP) reagent (1 x 0.5 mL)
▶ 0.5mM 2-Sulfobenzaldehyde (1 x 0.5 mL)
▶ 2.0 mL Collection Tubes (10)
▶ 7kDa, 2.0mL Zeba Columns (2)
▶ 10X PBS (1.5 mL)

 Documents

S-9010 Product Insert
S-9010 Conjugation Calculator
S-9010 Product Manual

 Technical Information

A. The Reaction

SoluLINK bioconjugation technology는 방향족 hydrazine과 방향족 aldehyde의 반응으로 형성된 안정적인 bis-arylhydrazone의 형성을 기반으로 한 기술입니다. S-HyNic (Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate aceton hidrazone, SANH)은 생체분자에 방향족 hydrazine moiety를 통합하는 데 사용됩니다. S-HyNic은 생체분자와 표면에 있는 아미노 그룹을 HyNic 그룹으로 직접 변환하는 아미노 반응형 시약입니다. S- 4FB (succinimidyl 4-formylbenzoate, SFB)는 아미노 그룹을 방향족 aldehyde (4-formylbenzamide (4FB) group)로 변환하는 데 사용됩니다. 4FB-modified 생체분자 또는 표면에 HyNic-modified 생체분자를 추가하면 conjugate가 형성됩니다 (Figure 1). Bis-arylhydrazone 결합은 92°C의 온도와 pH 2.0-10.0에도 안정적입니다. 낮은 pH, 즉 5.0 미만에서는 항체 면역 활성의 취약해지기 때문에 항체 접합의 권장 pH는 6.0입니다. Disulfide bond를 분해해 단백질의 활성을 저해할 수 있는 환원 시약이 필요한 thiol 기반 결합 프로토콜과 달리 HyNic-4FB 결합 커플은 disulfide bond를 그대로 둡니다. 금속, 산화제 또는 환원제가 필요하지 않습니다. 

Figure 1. Linking chemistry behind ChromaLINK technology.

B. Fastest, most efficient

HyNic/4FB 커플의 많은 장점을 더욱 돋보이게 하는 것은 aniline이 Schiff’s base의 형성을 촉진한다는 것을 밝힌 Dirksen et al.의 발견입니다. 이것은 특히 큰 생체분자 결합에 효과적입니다. 항체-단백질 결합의 경우, 반응 혼합물에 10 mM aniline을 첨가하면 1-2 몰당량의 두 번째 단백질을 사용하여 약 2시간 이내에 항체의 95% 이상이 conjugate로 변환됩니다.

C. Traceable modification

모든 반응의 재현성은 모든 성분의 정확한 특성화에 달려 있습니다. HyNic과 4FB 모두 방향족이기 때문에 colorimetric assay를 사용하여 쉽게 정량할 수 있습니다.

D. Traceable conjugation

HyNic-4FB 결합은 chromophoric입니다. 354nm에서 빛을 흡수하며 29,000 L/(mol*cm)의 molar extinction coefficient를 갖습니다.

이전 방법들과 비교했을 때, HyNic/4FB 기술은 다음과 같은 실질적인 이점을 제공합니다:

1. 완전한 반응: 이전의 모든 bi-functional linker 기반 결합에서는 반응이 결코 완성되지 않았으며 최종 제품에는 항상 결합되지 않은 단백질이 있었습니다. Aniline에 의해 촉매된 HyNic-4FB 결합 커플은 95% 이상의 conjugate를 산출합니다.
2. 효율적인 반응: Conjugate로의 완전한 전환을 위해 1-2 몰당량의 두 번째 단백질만 투입하면 되기 때문에 반응이 화학양론적으로 매우 효율적입니다.
3. 안정적 결합: Bis-arylhydrazone 결합은 92°C의 온도와 pH 2.0-10.0에도 안정적입니다.
4. 반응조건이 온화하며 (mild condition) 항체 변성이 없음: Disulfide bond를 분해해 단백질의 활성을 저해할 수 있는 환원 시약이 필요한 thiol 기반 결합 프로토콜과 달리 HyNic-4FB 결합 커플은 disulfide bond를 그대로 둡니다. 금속, 산화제 또는 환원제가 필요하지 않습니다.
5. 분광학적으로 결합 추적 가능: HyNic-4FB conjugate 결합은 chromophoric으로 354 nm에서 흡수되며 29,000의 molar extinction coefficient을 갖습니다.
6. 단백질의 HyNic moiety와 4FB moiety의 변형을 colorimetric assay를 통해 정량화 가능: 모든 반응의 재현성은 모든 성분의 정확한 특성화에 달려 있습니다. Molar Substitution Ratio (MSR; 단백질 당 통합된 HyNic 그룹의 수)는 2-sulfobenzaldehyde와의 반응이 28,500 L/(mol*cm)의 molar extinction coefficient로 350nm에서 흡수되는 chromophoric 제품을 생산하므로 colorimetric 측정으로 정량할 수 있습니다. 4FB 그룹의 MSR은 24,500 L/(mol*cm) 의 molar extinction coefficient로 350nm에서 흡수되는 348 nm에서 흡수되는 hydrazone을 형성하는 22-hydrazinopyridine과의 반응으로 colorimetric 측정으로 결정할 수 있다. 이 키트에는 두 MSR을 결정하는 데 필요한 모든 시약이 들어 있습니다.

E. The Keys to Successful Conjugation
SoluLINK bioconjugation technology를 사용하여 단백질-단백질 결합체를 재현성 있게 성공적으로 준비하기 위해 반드시 충족해야 하는 세 가지 중요한 요건이 있습니다:

1. Desalting: 변형 전에 시작 단백질을 철저히 desalting하여 amine 오염물질을 모두 제거하고 단백질을 1X Modification Buffer로 교환해야 합니다.
2. 단백질 농도: 권장 단백질 농도는 모든 단계에서 준수해야 합니다.
3. Molar substitution ratio: 단백질의 HyNic와 4FB의 molar ratio는 다음 단계를 계속하기 전에 결정되어야 하며 목적 범위 내에 있어야 합니다.