A. Product Description 올리고 4 몰당량을 첨가하면 단백질의 95% 이상을 conjugate로 전환됩니다. 높은 전환율과 교차 결합 시 형성된 고유의 UV 추적가능 특징이 연동되어 HPLC와 같은 size exclusion 정제 방법을 사용하여 과잉 올리고로부터 conjugate를 쉽게 정제하고 식별할 수 있습니다.
B. The SoluLINK Bioconjugation Method 이 키트는 단백질-올리고뉴클레오티드 conjugate를 준비하기 위해 SoluLINK의 3 단계 bioconjugation 방법을 사용합니다 (Figure 1). 첫 번째 단계는 4FB crosslinker로 올리고를 변형하며 두번째로 HyNic-modified 단백질을 형성합니다. 마지막으로, 두 개의 변형된 생체분자를 단순하게 혼합하면 4FB-modified 올리고뉴클레오티드와 HyNic-modified 단백질의 반응에 의해 안정적이고 UV 추적 가능한 결합이 형성될 것입니다. 이 기술은 기존의 교차 결합 방식과 비교했을 때 많은 실용적 장점을 가지고 있습니다: 높은 반응 수율 : 통상적 결합 수율은 시작 단백질을 기준으로 50-80%입니다. 효율적인 반응 : 3-4 몰당량의 올리고만 필요하며, 단백질의 90% 이상이 결합됩니다. 안정적인 conjugate 결합 : Conjugate 결합은 92°C의 온도와 pH 2.0-10.0에도 안정적입니다. 반응조건이 온화하며 (mild condition) 항체 변성이 없음 : Disulfide bond를 분해해 단백질의 활성을 저해할 수 있는 환원 시약이 필요한 thiol 기반 결합 프로토콜과 달리 HyNic-4FB 결합 커플은 disulfide bond를 그대로 둡니다. 금속, 산화제 또는 환원제가 필요하지 않습니다. 분광학적으로 결합 추적 가능 : HyNic-4FB conjugate 결합은 chromophoric으로 354 nm에서 흡수되며 29,000의 molar extinction coefficient을 갖습니다. 단백질의 HyNic moiety와 4FB moiety의 변형을 colorimetric assay를 통해 정량화 가능 : 모든 반응의 재현성은 모든 성분의 정확한 특성화에 달려 있습니다. Linker 그룹의 MSR, 즉 단백질 당 HyNic linker의 수는 colorimetric 측정으로 정량할 수 있습니다. 이 키트에는 단백질과 올리고 모두의 MSR을 결정하는 데 필요한 모든 시약이 들어 있습니다.
Figure 1. SoluLINK의 Bioconjugation chemistry를 사용하여 항체-올리고뉴클레오티드 conjugate를 생성하는 3 단계 프로세스. 항체에 HyNic 그룹을 통합하기 위해 S-HyNic으로 변형. 4FB crosslinker로 올리고를 변형. 마지막으로 HyNic-modified 항체를 4FB-modified 올리고뉴클레오티드와 반응. C. Protein-Oligonucleotide Conjugates: A Review 단백질의 다양성과 특이성은 올리고뉴클레오티드 혼성화의 특이성과 결합되어 아래와 같이 특정 단백질 검출 시약의 수가 무제한으로 증가합니다. 올리고-단백질 conjugate의 사용은 최초에 Sano et al.에 의해 100mer 올리고/항체 conjugate가 자신의 리간드에 결합되고 PCR에 의해 증폭되어 극도로 민감한 단백질 검출이 입증된 immuno-PCR (Polymerase Chain Reaction)이라는 기법에 의해 입증되었습니다. 이후 이러한 conjugate를 준비하기 위해 간단하고 효율적이며 고수율의 방법이 필요하게 되었습니다. . 1세대 immuno-PCR 프로토콜은 conjugate의 비특이적인 결합과 PCR 자체의 극도의 민감성으로 인해 높은 백그라운드 문제가 있었습니다. 이는 Fredriksson과 Lundegren이 개발한 Proximal Ligation Assay (PLA)에 의해 극복되었습니다. PLA 분석에서 서로 다른 epitope에 대한 두 개의 항체가 3’-end를 통해 40mer 5’-phosphorylated 올리고뉴클레오티드에 결합되고, 5’-terminus를 통해 60mer 올리고뉴클레오티드로 결합됩니다. 두 개의 올리고/항체 conjugate는 샘플과 배양되어 각각의 epitope에 결합할 수 있으며, 혼합물을 세척한 다음 이후 ligation되는 두 개의 올리고뉴클레오티드에 걸쳐 혼성화되는 ‘splint’ 올리고와 배양됩니다. Ligation 후, PCR은 ligation된 올리고에 대해 수행되며 정량 가능한 시그널을 생성합니다. 후속 작업에서 Fredriksson은 SoluLINK의 HyNic-4FB Conjugation 방법을 사용한 conjugate를 사용했습니다. Kozlov 등은 또한 단백질의 민감한 검출에 대한 올리고뉴클레오티드/항체 conjugate의 사용을 설명했습니다. 올리고뉴클레오티드/항체 conjugate는 항원 캡처 및 단백질 멀티플렉스 검출을 위한 항체 array에 사용되었고, 동일한 진단 플랫폼에서 세포 분류에도 사용되었습니다. 또한 올리고뉴클레오티드/단백질 conjugate는 CpG 올리고뉴클레오티드/단백질 conjugate를 이용한 아쥬반트활성 (adjuvanticity)를 높이기 위해 백신에도 사용되었습니다. D. Accessing 4FB-modified Oligonucleotides 안정적인 disulfide-cleavable 4FB 올리고뉴클레오티드는 다음과 같은 여러 가지 방법으로 얻을 수 있습니다: 5’-4FB oligonucleotide : 4FB-phosphoramidite : 4FB-Phosphoramidite (Figure 2의 1)는 올리고뉴클레오티드 고체상 합성 동안 5'-4FB 그룹의 통합에 사용할 수 있습니다. 표준 커플링 프로토콜이 사용되며 수율은 모든 아미노 modifier와 유사합니다. 4FB Phosphoramidite는 직접 구매하거나 (카탈로그 #S-1005) 5'-4FB 올리고뉴클레오티드를 주문할 수 있습니다. 5’-amino oligonucleotides : 5’-amino 올리고뉴클레오티드는 S-4FB와 함께 간단한 고수율의 변형 단계로 5’-4FB modified 올리고뉴클레오티드로 변환될 수 있습니다 (Figure 2의 2). SoluLINK® Protein-Oligo Conjugation Kit에는 S-4FB와 5’-아미노 올리고뉴클레오티드를 5'-4FB-올리고뉴클레오티드로 전환하는 데 필요한 모든 시약과 재료가 포함되어 있습니다. 3’-4FB oligonucleotide : 3'-아미노 올리고뉴클레오티드는 S-4FB 와 함께 쉬운 고수율의 변형 단계로 3'-4FB modified 올리고뉴클레오티드로 변환됩니다 (Figure 2의 2). SoluLINK® Protein-Oligo Conjugation Kit에는 S-4FB와 3'-아미노 올리고뉴클레오티드를 3'-4FB-올리고뉴클레오티드로 전환하는 데 필요한 모든 시약과 재료가 포함되어 있습니다. 5’- and 3’-4FB disulfide-cleavable oligonucleotides :
5’-과 3’-아미노 올리고뉴클레오티드는 쉬운 고수율의 변형 단계로 S-SS-4FB를 사용하여 disulfide-cleavable 올리고뉴클레오티드로 변환될 수 있습니다. 이 제품은 별도로 제공됩니다 (카탈로그 #S-1037) (Figure 2의 3). Figure 2. Schematic representation of the conversion of an amino-modified oligonucleotide to a 4FB-oligonucleotide with S-4FB (2) (top) and structures of 4FB-phosphoramidite (1) and S-SS-4FB (3), the reagent used to convert an amino- oligonucleotide to a 4FB-SS-oligonucleotide.
E. The Keys to Successful Conjugation SoluLINK bioconjugation technology를 사용하여 단백질-올리고뉴클레오티드 conjugate를 재현성 있게 성공적으로 준비하기 위해 반드시 충족해야 하는 세 가지 중요한 요건이 있습니다: Desalting: 변형 전에 시작 단백질을 철저히 desalting하여 amine 오염물질을 모두 제거하고 단백질을 1X Modification Buffer로 교환해야 합니다. 단백질 농도: 권장 단백질 농도 (1 – 5mg/ml)는 모든 단계에서 준수해야 합니다. Molar substitution ratio: 단백질의 HyNic와 4FB의 molar ratio는 다음 단계를 계속하기 전에 결정되어야 하며 목적 범위 내에 있어야 합니다.
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